MiR-125b在细毛羊与绒山羊皮肤组织中差异表达及其靶基因的筛选与鉴定

【摘要】随着世界毛皮消费市场的发展，我国的羊毛因其质地柔软、毛色洁白、保暖舒适等特点在国际市场上拥有良好的口碑。在众多羊毛品种中，细毛羊与绒山羊以不同的羊毛质地受到消费者最佳青睐。细毛羊与绒山羊的被毛生长过程受营养、环境、代谢和基因调控等诸多因素的调节，其中基因调控最为关键。近几年科研人员在毛囊发育的调控机制方面做了大量工作，并取得了一定进展。但是，这些研究大都倾向于传统调控却忽视了转录后调控的研究。直到miRNA的出现，致使这类新的调控层次，即转录后调控成为研究的热点。MiRNA是一类新发现的内源性非编码转录后调控小RNA，通过作用于靶基因mRNA的非编码区抑制靶基因翻译或引起降解，从而参与基因表达调控，在发育、增殖、分化、凋亡等基本的生物学过程中起重要作用。自从Lin-4在线虫中被人们发现以来，越来越多miRNA在多个物种中被鉴定出来。但是羊源miRNA的鉴定却很少，尤其是位于细毛羊与绒山羊皮肤组织中的miRNA更是甚少。如今，刚刚兴起的第二代高通量测序技术为miRNA的鉴定提供了便利，致使鉴定工作不再局限。因此，本研究在前期Solexa高通量测序的基础上，从中随机挑选10个差异表达的miRNA，应用qPCR技术检测Let-7a-1、miR-184、miR-101a、miR-200a、miR-145、miR-17、miR-451、miR-30b、miR-29b和miR-125b在不同品种羊皮肤组织中的相对表达水平，以验证Solexa高通量测序结果。同时重点选择差异表达极显著（**p<0.01）的miRNA-125b从体内外进行系统分析，通过miRGenV3.0、TargetScan、RNA22等软件预测其靶基因，并进一步通过GO和KEGG分析筛选出与毛囊发育相关的靶基因；随后通过荧光定量、western-blot及双荧光素酶检测系统选择性地对候选靶基因（如MXD4、FGFR2）进行识别验证，并采用流式和荧光显微镜检测法检测转染效率。最后对绒山羊与毛囊发育相关黑皮质素受体家族成员MC4R进行序列分析。该试验从miRNA这类新的调控水平研究细毛羊与绒山羊皮肤组织中毛囊的生长发育，阐明miR-125b及其靶基因在二者皮肤毛囊发育中表达差异的机理，为提高细毛羊与绒山羊毛发产量和品质提供新的思路和研究平台。具体研究结果显示：（1）Let-7a-1、miR-184、miR-101a、miR-200a、miR-145、miR-17、miR-451、miR-30b、miR-29b和miR-125b均在两组织样品中表达。且10个miRNA在细毛羊皮肤组织中的表达水平均高于在绒山羊皮肤中的表达。通过与高通量测序结果进行对比发现Let-7a-1与miR-184的表达水平与测序结果相反。（2）通过生物信息学方法预测到miR-125b的靶基因72个，后经GO和KEGG分析，筛选出与毛囊发育相关的靶基因6个：CBFB、MXD4、FGFR2、EDN1、DLL4、MCRs。利用NCBIBLAST得到细毛羊与绒山羊的靶基因MXD4和FGFR2的同源性分析结果，表明：与绵羊、牛等物种的同源性均达到85%以上。（3）荧光定量结果表明：在mRNA水平上，靶基因MXD4和FGFR2在绒山羊皮肤组织中表达量高于细毛羊。Western-blot检测结果表明：在蛋白水平上，靶基因MXD4和FGFR2在绒山羊皮肤组织中表达量高于细毛羊，与定量结果一致。（4）通过流式及荧光显微镜对HEK-293T细胞进行转染效率检测，当细胞铺板率达90%，mimics与质粒载体共转染的最终浓度分别为50nM和200ng时，达到了最优的转染效果。（5）双荧光素酶报告基因检测结果表明：FGFR2及MXD4为miR-125b的靶基因。（6）克隆结果表明：MC4R无内含子，长924bp，编码304个氨基酸，具有7个跨膜结构域。同源性分析显示：与绵羊、牛、猪、马、人等同源性均高于85%，与绵羊同源性最高，可达98%，与系统进化树分析结果一致。与其它哺乳动物相比，有9处氨基酸位点易发生突变，它们是第93、152、160、162、165、182、213、221、230位点处。其中，有四处（152、160、162、165）发生于第二胞内环拓扑区，有三处（213、221、230）发生于第三胞内环拓扑区，有一处（93）发生于第二跨膜结构域中，另一处（182）发生于第四跨膜结构域中。
【作者】曲海娥；
【导师】张巧灵；
【作者基本信息】吉林大学，基础兽医学，2014，硕士
【关键词】MiRNA-125b；细毛羊；绒山羊；靶基因；毛囊发育；

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